本发明公开了一种二硫苏糖醇的双光子荧光探针及其制备方法。该探针结构通式如式(I)所示：该探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。且该探针还具有高特异性，在进行相应DTT检测过程中基本不受其他组分的干扰，可用于环境和活细胞内DTT的实时测定，具有广阔的应用前景。