本发明属于纳米功能材料、临床分析及生物电化学传感技术领域，提供了一种同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物传感器的制备方法及应用。所述传感器使用印刷电极集成3个工作电极，可同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物：癌胚抗原、糖类抗原125及糖类抗原15-3，显著提高了检测效率。该免疫传感器的构建过程简单和超灵敏度的优势对临床早期诊断乳腺癌具有重要的科学意义和应用价值。