本发明公开了一种具有叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子的制备方法。通过将氯金酸溶液、柠檬酸三钠溶液和硼氢化钠制备出发荧光的金簇纳米粒子，利用11-巯基十一烷酸和叠氮十一烷基硫醇功能化金簇表面；叶酸与炔丙胺通过N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺连接剂连接，形成炔基化叶酸；利用点击化学方法，炔基与叠氮基发生环加成反应，制备出叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子。叶酸受体靶向和荧光双功能金簇纳米粒子能够选择性识别叶酸过表达的K562细胞，对其进行荧光检测，在激发波长和发射波长分别为470nm和650nm下进行测定。