本发明公开了一种操作简单、低成本、多通道的电化学三维微流控纸芯片的制备及其现场检测的方法。本发明采用全打印级粘合堆叠模式，分贝在三张A4大小的普通滤纸上，批量打印出疏水蜡图案。制备过程还包括以下步骤：批量打印疏水蜡图案；熔蜡成型；在滤纸上批量丝网印刷阵列工作电极、参比电极与对电极；在滤纸的无工作电极面上依次批量打印辣根过氧化物酶和氧化酶；电化学三维微流控纸芯片裁剪；制备双面胶带片；将滤纸片通过双面胶带片粘合在一起；制备电化学三维微流控纸芯片夹。一种电化学三维微流控纸芯片的现场检测的方法，包括如下步骤：用电化学三维微流控纸芯片夹将纸芯片夹住；然后插入十六铜手指插槽；通过多路复用器连接电化学工作站。