本发明属于纳米材料科学和微流控芯片技术领域,涉及一种基于荧光分子印迹二氧化硅纳米微球修饰纸芯片的制备方法,解决纸芯片不易进行复杂功能化修饰的问题。首先溶胶-凝胶法制备单分散性的二氧化硅纳米粒子,并对二氧化硅纳米粒子进行表面氨基改性;再通过Suzuki反应合成对硝基苯有高选择性和高灵敏度的荧光共轭聚合物;将共轭聚合物通过共价键键合并交联到二氧化硅纳米粒子表面,形成荧光分子印迹纳米微球。将荧光分子印迹纳米微球均匀固定到纸芯片检测区域表面,即得到荧光分子印迹纳米微球修饰纸芯片。本发明可以实现对纸芯片快速,简单的功能化修饰,进而对水中微量硝基苯的高灵敏检测。